第1434章 摸着石头过河
棉花测试的结果，让所有人都始料未及。
弗里茨用棉球从M7的足背开始，一点一点向上移动。高速摄像机以每秒一千帧的速度记录，任何肉眼无法捕捉的微小肌肉颤动，都会被定格在慢放的画面里。
“足背，无反应，“伊娃盯着实时回放的屏幕，“踝部，无反应。小腿……等等，停。“
她按下暂停键，把画面倒回三帧，然后放大到像素级别。
M7小腿中段的皮肤上，出现了一道几乎看不见的波纹，不是肌肉的收缩，是皮肤本身的颤动，像风吹过湖面时最细微的涟漪。弗里茨的棉球刚刚掠过那里，力道轻得几乎称不出重量。
“这是触觉反应，“伊娃的声音有些发紧，“Aβ纤维介导的轻触觉，阈值极低。正常灵长类的轻触觉阈值在0.5到1克力之间，刚才这个刺激，估计不到0.2克力。“
“说明什么？“杨平问道。
“说明两个问题，“伊娃调出之前的痛阈数据，“第一，M7的感觉通路确实在恢复，而且恢复的顺序符合理论预测——痛觉先恢复，然后是轻触觉，最后是本体感觉。第二，它的触觉阈值比正常值低，意味着可能存在触觉过敏，和之前的痛觉过敏是同一个机制——中枢敏化。“
韦伯走过来，看着屏幕上那道几乎看不见的波纹。
“中枢敏化，“他重复着这个词，“脊髓损伤后最常见的并发症之一。病人不是感觉不到，是感觉太多了。正常的触摸变成疼痛，正常的温度变成烧灼。“
“对，“杨平点头，“而且中枢敏化一旦形成，很难逆转。它涉及脊髓背角神经元的突触可塑性改变，NMDA受体激活，钙离子内流，然后是一系列级联反应，MAPK通路、CREB磷酸化、基因表达改变。这是一个正反馈循环，越敏化，越兴奋；越兴奋，越敏化。“
“所以我们面临一个悖论，“曼因斯坦皱着眉头，“原细胞激活策略促进了神经再生，但再生的神经可能携带了'错误的信号'，导致中枢敏化，我们治好了瘫痪，却可能制造了一个疼痛的病人。“
会议室里再次陷入沉默。
“不，“杨平突然说，“不是悖论，是时间窗的问题。“
他走到白板前，画了一条时间线。
“中枢敏化的形成，需要两个条件：第一，异常的神经传入，损伤后残留的或再生的神经纤维发放异常冲动；第二，脊髓背角神经元的可塑性改变，突触强度增加，抑制性中间神经元功能下降。这两个条件，都需要时间。“
他在时间线上标出两个点：“术后第三周，痛觉恢复，这是第一阶段的异常传入；术后第四周，触觉恢复，如果放任不管，再过两到三周，中枢敏化就会固化。“
“但我们现在知道了，“他的笔尖点在第四周的位置上，“我们可以在这个时间窗内干预，阻止敏化的固化。“
“怎么干预？“唐顺问。
“两种思路，“杨平放下笔，“第一种，减少异常传入。比如用钠通道阻滞剂，抑制损伤神经纤维的异位放电。但钠通道阻滞剂会影响正常的神经传导，可能抵消我们的恢复效果。“
“第二种呢？“
“增强抑制性调控，“杨平继续说，“脊髓背角有大量的抑制性中间神经元，主要是GABA能和甘氨酸能的。中枢敏化的一个关键机制，就是这些抑制性神经元的功能下降。如果我们能增强它们的活性，就能在不影响正常传入的情况下，阻断敏化的正反馈循环。“
“GABA受体激动剂？“韦伯问。
“对，但不只是简单的激动剂。GABA_A受体是氯离子通道，持续激活会导致受体脱敏，效果越来越差。我们需要的是一种'智能'的调控策略，只在异常兴奋的时候增强抑制，正常活动的时候不干扰。“
“这听起来像是……“莉娜推了推眼镜。
“闭环神经调控，“伊娃接过话头，“和我的生物传感器同一个思路。实时监测脊髓背角的电活动，当检测到异常高频放电时，自动释放GABA能激动剂；正常放电时，不释放。“
“但GABA能激动剂怎么局部释放？“汉斯皱眉，“全身给药会穿过血脑屏障，导致镇静、认知障碍。局部给药需要植入泵，感染风险高。“
“不需要外源性药物，“杨平摇头，“我们可以用光遗传学。“
“光遗传学？“曼因斯坦瞪大眼睛，“在灵长类身上？“
“对，“杨平点头，“2016年就有团队在恒河猴的视觉皮层做了光遗传学实验，证明了安全性和可行性。我们的方案是：用病毒载体把光敏感离子通道，比如NpHR，一种氯离子泵，导入M7脊髓背角的抑制性中间神经元。然后用植入式光纤，在检测到异常电活动时，发射黄光激活NpHR，增强局部抑制。“
“这太超前了，“唐顺倒吸一口凉气，“病毒载体、光遗传学、闭环调控，三个技术叠加在一起，任何一个出问题都是灾难。“
“但如果我们不做，“杨平看着他，“M7可能会在恢复运动功能的同时，承受慢性疼痛的折磨。你愿意看到它一边走路，一边痛得发抖吗？没有在分子层面提出有效解决方法之前，这是最好的方法。“
唐顺张了张嘴，没有说话。
韦伯打破了沉默：“杨教授，你的方案在理论上是成立的。但光遗传学在灵长类脊髓中的应用，还没有先例。我们需要做大量的预实验，验证病毒载体的靶向性、光刺激的深度、和长期安全性。“
“我知道，“杨平说，“所以我们分两步走。第一步，体外验证，在M7的脊髓切片上，测试病毒载体的转染效率和光刺激的效果。第二步，如果体外成功，再在M7身上做体内实验。“
“时间上呢？“伊娃问，“按照你的时间线，我们最多还有两到三周的时间窗。“
“体外验证需要一周，“杨平算了算，“如果成功，体内实验需要两到三天准备，一周内可以完成植入。刚好赶上。“
“如果失败呢？“曼因斯坦问。
杨平沉默了几秒钟，然后说：“那就用备选方案，鞘内注射巴氯芬，一种GABA_B受体激动剂。效果不如光遗传学精准，但可以全身性增强抑制性调控。副作用是肌张力降低，可能影响运动恢复。“
“所以光遗传学是A方案，巴氯芬是B方案，“韦伯总结，“我同意这个计划。但有一个条件，体外验证必须由我亲自来做，光遗传学是我的老本行，我在海德堡的时候做过类似的实验。“
“好，“杨平点头，“韦伯教授负责体外验证，伊娃负责闭环传感器升级，莉娜负责数据分析模型，汉斯负责病毒载体和光纤制备。唐顺，你协调所有资源，确保一周内出结果。“
“明白！“
体外验证开始。
韦伯亲自主刀，从M7的脊髓损伤区取了一小块组织，大约两立方毫米，放在冰冷的人工脑脊液中，切成了三百微米厚的薄片。这些薄片被转移到培养皿中，保持存活状态，可以持续记录电生理活动四到六个小时。
病毒载体是AAV9-hSyn-NpHR-EYFP，一种经过改造的腺相关病毒。AAV9对神经元有高度的嗜性，hSyn启动子确保NpHR只在神经元中表达，EYFP作为荧光标记，方便在显微镜下观察转染效率。
韦伯把病毒溶液滴在脊髓切片上，孵育两个小时。然后用PBS冲洗三遍，放在共聚焦显微镜下观察。
“转染效率，“他调整着焦距，“大约百分之三十五。“
“百分之三十五，“曼因斯坦在旁边记录，“够吗？“
“理论上，脊髓背角的抑制性中间神经元占总神经元数量的百分之二十到三十。百分之三十五的转染效率，意味着大部分抑制性神经元都能被靶向，足够了。“
下一步是电生理验证，韦伯把一片转染过的脊髓切片放到电生理记录槽中，用玻璃微电极记录背角神经元的自发放电。同时，他在切片的上方放置了一根直径两百微米的光纤，连接到一台黄色激光器上。
“基线放电频率，“他看着示波器，“每秒五赫兹，正常范围。“
然后他打开了激光器。一束微弱的黄光透过光纤，照射在脊髓切片的表面。
“光强，一毫瓦每平方毫米，波长，五百九十纳米。“
示波器上的波形变了，自发放电频率从每秒五赫兹降到了每秒一赫兹，降幅百分之八十。
“抑制效果确认，“韦伯的声音很平静，但曼因斯坦注意到他的手微微颤抖，“NpHR被激活后，氯离子内流，神经元超极化，放电减少。“
“可逆吗？“杨平问。
韦伯关掉激光器，十秒钟后，放电频率恢复到每秒四点八赫兹。
“完全可逆。“
会议室里爆发出一阵压抑的欢呼。唐顺和汉斯击了一下掌，莉娜在笔记本上飞快地敲着字，伊娃难得地露出了一丝微笑。
但韦伯没有笑，他盯着那片脊髓切片，看了很久，然后说：“这只是体外，体内的环境复杂得多，炎症、免疫反应、胶质瘢痕、血流变化。体外成功，不代表体内能成功。“
“我知道，“杨平说，“但我们至少证明了，这个方向是对的，科研就是摸着石头过河。“
“摸着石头过河？”
韦伯捉摸着这句话，他赞叹：
“这是富有哲理的一句话。”
紧接着，体内实验也开始进行。
这一次，手术的规模比前两次都大。杨平主刀，曼因斯坦协助，伊娃负责电生理监测，汉斯负责病毒注射和光纤植入，韦伯在台下观摩。
手术的第一步，是病毒注射。汉斯用一根玻璃微注射针，把五微升AAV9-hSyn-NpHR-EYFP溶液缓慢地注入M7的脊髓背角，双侧，每个注射点一微升，共十个注射点。注射的速度极慢，每分钟零点一微升，以避免压力损伤。
“病毒注射完成，“汉斯汇报，“等待十五分钟，让病毒扩散。“
十五分钟后，第二步，光纤植入。伊娃设计了一套微型光纤阵列，四根光纤，直径各两百微米，排列成一个菱形，覆盖脊髓背角的主要区域。光纤的末端连接到一个皮下植入的LED模块上，模块由无线充电供电，可以通过外部控制器调节光强和频率。
“光纤植入完成，“杨平说，“闭合切口。“
手术持续了一个多小时。当M7从麻醉中醒来时，它的后肢肌力没有变化，病毒和光纤本身不会影响运动功能。但所有人都知道，真正的考验还没有开始。
NpHR的表达需要时间。病毒进入神经元后，需要三到五天才能表达出足够的蛋白。所以术后第五周的前半周，是等待期。
等待的日子里，研究所的气氛紧张得像一根绷紧的弦。每天早上，伊娃都会给M7做电生理监测，记录脊髓背角的自发放电频率。前三天，数据没有明显变化，NpHR还没有表达足够。
第四天，变化出现了。
M7的背角自发放电频率从正常的每秒三到五赫兹，突然升到了每秒十二赫兹。这是一个危险的信号，异常高频放电，意味着中枢敏化正在形成。
“启动光刺激，“韦伯说。
伊娃按下了控制器的按钮，黄色的光通过光纤，照进M7的脊髓背角。
十秒钟后，放电频率降到了每秒六赫兹。二十秒后，降到了每秒四赫兹。一分钟后，稳定在每秒三点五赫兹，比基线还低，说明抑制效果良好。
“有效，“韦伯的声音传来，带着一丝颤抖，“光遗传学闭环调控，有效。“
杨平长长地出了一口气，他看着控制器上那个小小的黄色指示灯，觉得那是我见过的最美的光。
其实科研就是这样，摸着石头过河，谁也不知道结果怎么样，只能边走边调整，慢慢地就走通一条路。如果没有大胆的开始，无论如何也不会有正确的路。